در پي اهميت آنزيم ليپاز طي اين تحقيق ابتدا توالي ژنومي آنزيم ليپاز از باكتري سرمادوست Psychobacter sp.C18 گرفته شد؛ و پس از وارد شدن توالي ژني در پلاسميد بياني pET28a، وارد باكتري DH5α مستعد دريافت پلاسميد شد و پرايمرهايي جهت شناسايي ژن مربوطه موجود در پلاسميد طراحي گرديد؛ و از تكنيك كلوني PCR جهت اطمينان از وجود قطعه ژن مورد هدف استفاده گرديد. سپس پلاسميد pET-28a را كه حاوي ژن بيان آنزيم ليپاز بود را براي برسي بيان پروين وارد باكتري مستعد بياني BL21 گرديد و پس ازالقاي بيان پروتئين ، پروتئين بيان شد و به كمك ستون كروماتوگرافي تمايلي نيكل سفارز، آنزيم ليپاز توسط شيب غلظتي ايميدازول استخراج گرديدو جهت سنجش وزن آنزيم از تكنيك SDS-PAGE استفاده شد؛ و وزن تقريبي آن حدود 35 كيلودالتون تقريب زده شد. پس از انجام تست رنگ سنجي برادفورد و تعيين غلظت پروتئين كل، دماي بهينه آنزيم 30 درجه سانتي گراد براورد شد و پايداري دمايي آن از دماي 4تا60درجه سانتي گراد به مدت 60 دقيقه سنجيده شد و همچنين pH بهينه و پايداري pH آن در pHهاي 7 ,8 و9 به مدت 140 دقيقه مورد بررسي قرار گرفت و سپس آنزيم بر روي بستر نانوهيبريدي كلسيم و آگارز اصلاح شده با ذرات آمين به صورت فيزيكي تثبيت شد؛ همچنين پس از يافتن غلظت مناسب گلوتارآلدئيد توسط گلوتارآلدئيد به صورت كولانسي تثبيت شد؛ و جهت اطمينان توسط الكتروسكوپ الكتروني تصوير برداري شد. همچنين طي اين آزمون دما بهينه وپايداري دمايي آنزيم تثبيت شده ارزيابي شد كه پس از تثبيت آنزيم فعاليتي نسبي بيشتري را در دماهاي بالا از خود نشان داد همچنين سبب افزايش پايداري دمايي گرديد و pH بهينه و پايداري آن هم سنجيده شد. همچنين پارامترهاي سينتيكي، ترموديناميكي و رفتار آنزيم در حضور نمك هاي فلزي، حلال هاي طبيعي، دترجنت ها و مهاركننده ها در هر دو حالت آزاد و تثبيت شده مورد بررسي قرار گرفت؛ كه طي آن نمك هاي: كلسيم كلريد، منيزيم كلريد، پتاسيم كلريد وسديم كلريد فعال كننده بودند همچنين آنزيم درحضور حلال هاي طبيعي نظير متانول ,اتانول و پروپانول قادر به فعاليت در حالت آزاد و پس از تثبيت بود. نتايج نشان داد آنزيم پس از تثبيت مقاومت بيشتري در برابر دترجنت ها بدست آورد. آنزيم پس از تثبيت كولانسي قادر است تا 50 درصد فعاليت خود را تا 8 بار استفاده مجدد از آنزيم حفظ كند.

آنزيم ليپاز از گونه سايكروباكتر c18 را از طريق پلاسميد pet 28 كه حاوي ژن آنزيم ليپاز است، وارد سلول مستعد BL21 شد و القا و بيان آنزيم ليپاز با غلظت 5/0 ميلي مولار IPTG صورت گرفت. سپس از طريق ستون تخليص نيكل –آگارز پروتئين به يون نيكل از طريق دنباله پلي هيستيدين متصل شد و كيفيت تخليص آنزيم و اندازه مولكولي آن از طريق SDS PAGE موردبررسي قرار گرفت؛ و براي اولين بار آنزيم ليپاز روي بستر كيتوسان – زينك اكسيد به روش جذب فيزيكي و پيوند كووالانسي تثبيت شد. براي انجام فرآيند تثبيت بستر نانو هيبريدي كيتوسان –زينك اكسيد سنتز شد و با كمك طيف‌سنجي پراش انرژي پرتوايكس (EDX) از كراس لينك بين دو نانوذره اطمينان حاصل شد، روي بستر سنتزي فرآيند تثبيت فيزيكي و كووالانسي آنزيم ليپاز انجام گرفت. نتايج تثبيت آنزيم ليپاز نشان داد كه آنزيم كارايي كاتاليتيكي خود را در تثبيت فيزيكي و كووالانسي به ترتيب در حدود 90 و 96 درصد حفظ كرده است درعين‌حال پايداري آنزيم افزايش‌يافته است براي مثال نيمه‌عمر آنزيم در دماي 35 درجه نشان داد كه در تثبيت فيزيكي 7% و در تثبيت كووالانسي 15 درصد نيمه‌عمر افزايش داشته است. درعين‌حال دلتاجي استار هم در تثبيت افزايش‌يافته است كه اين نشان مي‌دهد بايد انرژي بيشتري صرف كنيم تا آنزيم دچار دناچوراسيون شود و باعث از دست رفتن فعاليت آنزيم شود. پايداري ذخيره‌اي تثبيت فيزيكي آنزيم در دماي 25 درجه پس از گذشت 35 روز در مقايسه باحالت محلول 200 درصد افزايش داشته است و در تثبيت كووالانسي 320 درصد افزايش داشته است. آنزيم در تثبيت فيزيكي و كووالانسي تا سيكل دهم بيش از 50% فعاليت داشته است و در سيكل هشتم بيش از 80 در صد فعاليت خود را حفظ مي‌كند و اين نكته‌ي حائز اهميتي است زيرا در مصارف صنعتي باعث صرفه‌جويي مي‌شود. تثبيت كووالانسي و فيزيكي در برابر افزايش غلظت نمك‌ها به‌خوبي توانسته مقاومت كند و اثر محافظتي داشته باشد براي مثال نمك KCl با افزايش غلظت در تثبيت كووالانسي تا 180% توانسته فعاليت داشته باشد. هم‌چنين آنزيم توانسته در برابر حلال‌هاي، دترجنت و شلاتور نقش محافظتي داشته باشد. Designing and production of stabilized recombinant lipase enzyme from Psychrobacter sp. C18 on Synthesized nanocomposite chitosan-zinc oxide with high stability for use in industrial applications